Blog de Andrea Rios



La terapia génica satisface el anhelo de la medicina de curar etiológicamente (remover la causa de) una enfermedad. La biología actual sostiene que todo ser vivo resulta de la interacción de su genoma con el medio ambiente, historia o circunstancias.La terapia génica para curar la diabetes todavía debe superar algunas barreras en la investigación básica, pero se presenta como una buena alternativa a los métodos convencionales. Mediante la biotecnología se pretende curar la enfermedad restaurando la liberación endógena de insulina o modificando las concentraciones de glucosa en sangre, así como desarrollando distintas estrategias adaptadas a las necesidades de los pacientes con diabetes tipo 1 o 2.

Los mecanismos patogenéticos de la diabetes mellitus tipo 2 son la resistencia a la insulina y un déficit secretor de insulina. La racionalidad de utilizar leptina recombinante humana en esta enfermedad se basa en los efectos sensibilizadores a la insulina de esta hormona. 













Diversos estudios han demostrado que la leptina mejora la resistencia a la insulina, el control glucémico, y la dislipemia en ratones con diabetes tipo 2, sin embargo los resultados de dos ensayos clínicos mostraron que el tratamiento con leptina fue ineficaz para mejorar la resistencia a la insulina en individuos obesos diabéticos. Dado que un número importante de diabéticos tipo 2 son obesos, será importante evaluar los efectos antidiabéticos de la leptina en aquellos sujetos que muestran niveles normales o bajos de leptinemia. La identificación de los mecanismos moleculares de la resistencia a la leptina será de crucial importancia en el tratamiento tanto de la obesidad como de la diabetes tipo 2. Basándose en experimentos con animales se ha sugerido que la amilina sería uno de estos sensibilizadores. La amilina podría actuar con la leptina para inducir una reducción del peso. En un ensayo clínico en fase II, la combinación de leptina y pramlintida produjo una pérdida de peso significativa. Este efecto se acompañó por una tendencia a la mejoría de parámetros metabólicos como el colesterol total, LDL, glucemia e insulinemia y resistencia a la insulina. 







FUENTE:

Sorrades; Terapia génica para curar la diabetes;ELSEVIER [INTERNET] 2003 Abril [citado el 30 de Junio del 2015]; Volumen 22 no.4. Disponible en : 


Carlos y Valanzuela; Ética científica de la terapia génica de individuos. Urgencia de la Cirugía Génica del ADN; SCIELO  [INTERNET] 2003 Octubre [citado el 30 de Junio del 2015] Volumen 131 no. 10. Disponible en: 

DAVID ARAÚJO-VILAR, CRISTINA GUILLÍN-AMARELLE, SOFÍA SÁNCHEZ-IGLESIAS, ANA CASTRO, FELIPE F. CASANUEVA; Uso terapéutico de la leptina recombinante humana;Revista Española Endocrinol Pediatric [INTERNET]2014 Abril [citado el 30 de Junio del 2015]; Volumen 5 no.1.Disponible en:

http://www.endocrinologiapediatrica.org/modules.php?name=articulos&idarticulo=223&idlangart=ES&preproduccion=&in_window=1

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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre

Célula madre o stem cell es una célula totipotente/pluripotente o multipotente, capaz de generar uno o más tipos de células diferenciadas y que además posee la capacidad de autorrenovación. En los animales superiores, cuando nos referimos a células madre, pensamos en las células totipotentes embriónicas, que a su vez se clasifican en los siguientes grupos: células madre embriónicas (ES), células madre germinales (EG) y células madre de los teratomas y teratocarcinomas.




















Las stem cells son transfectadas con una construcción que lleva un gen de resistencia a un antibiótico (neomicina) el cual está bajo el control del gen de la insulina. De esta manera, se seleccionan las células que al diferenciarse activarán únicamente dicho promotor; posteriormente, se añade a la construcción un marcador no tóxico, pero fácilmente perceptible: la proteína fluorescente del verde (GFP), de manera que las células expresan insulina y proteína verde, lo que permite una selección más fina de estas. De ese modo, se estableció la línea celular IB/3x-99 derivada directamente de un cultivo de células ES de ratón, las cuales tienen la capacidad de formar los agregados de las células que secretaron la insulina de una manera dependiente de la glucosa.21 Para probar la capacidad funcional de estas células in vivo, los agregados celulares fueron implantados en el bazo de ratones. La mayoría de los animales presentaron un control de la glucosa de la sangre. Sin embargo, el 40 % de los trasplantados desarrollaron a las 12 semanas una hiperglicemia.22 

A día de hoy las aplicaciones clínicas de la terapia celular se limitan a las células madre adultas. Es posible que en el futuro las células madre embrionarias se apliquen de forma terapéutica, pero hoy en día las limitaciones que hemos mencionado anteriormente, hacen inviable su utilización. Las aplicaciones de las células madre las podemos dividir en dos grupos principales: en primer lugar, su potencial de diferenciación permitiría utilizarlas para regenerar tejidos destruidos o dañados, como es el caso de enfermedades neurodegenerativas, diabetes o patología cardíaca; en segundo lugar, las células madre podrían ser empleadas como vehículo terapéutico de genes, como en el caso de enfermedades monogénicas así la hemofilia o incluso como vehículo de terapias antitumorales o antiangiogénicas. 





FUENTE:

Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS et al. Transplante celular y terapia regenerativa con células madre.SCIELO [Internet] 2006 [citado el 28 de junio del 2015]; Disponible en: 
http://scielo.isciii.es/scielo.php?pid=S1137-66272006000400018&script=sci_arttext

Dra. M. Eugenia Mato Matute. Células madre: un nuevo concepto de medicina regenerativa.SCIELO [Internet] 2004 [citado el 28 de junio del 2015]; Volumen 15 no.2. Disponible en:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1561-29532004000200007
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                        TRANSGÉNICO : LA INSULINA


Desde su descubrimiento, la insulina se ha convertido en una de las moléculas más estudiadas de la historia de la medicina. Como todos sabemos, la insulina es una proteína  relacionada con la diabetes, una enfermedad que afecta a un amplio porcentaje de la población.
Antes se administraba insulina para tratar la diabetes, se obtenía de hígado de ganado: vacas, cerdos, con un efecto similar a la especie humana, pero a su vez con problemas que causaban reacciones de tipo alérgico. En 1963, la insulina se convirtió en la primera proteína en ser sintetizada in vitro, por Meinhofer y colaboradores, pero con un rendimiento bastante pobre, lo que impedía su utilización masiva contra la diabetes.
Así llegamos a la insulina recombinante ya que, en el año 1978, gracias al desarrollo de la ingeniería genética se consigue la síntesis de insulina mediante técnicas biotecnológicas.

El procedimiento llevado a cabo fue muy ingenioso, utilizando las bacterias Escherichia coli (E. coli para los amigos) como factorías en miniatura para producir de forma separada las cadenas A y B de la insulina humana, introduciendo para ello los genes  que las codifican en las bacterias mediante un vector (pBR322). Posteriormente se llevaba a cabo la purificación, plegamiento y unión in vitro de las cadenas, mediante la oxidación de las cisteínas para formar los puentes disulfuro de la proteína activa.





El resultado fue una insulina humana (denominada comercialmente Humulin), más barata de producir, potente y segura, ya que no mostraba los problemas que producían las homólogas animales. Empezó a distribuirse a principios de los años 80 como tratamiento contra la diabetes, siendo (una vez más) la primera proteína recombinante aprobada como medicamento.






Hoy en día, prácticamente todos los diabéticos son tratados con algún tipo de insulina recombinante, No obstante, la investigación no termina aquí. En los últimos años se está consiguiendo que otros organismos genéticamente modificados produzcan insulina humana, con numerosas ventajas. Por ejemplo, científicos argentinos han obtenido vacas transgénicas que producen leche enriquecida en pro-insulina humana, que evitarían tener que purificar la proteína, pues únicamente habría que consumir la leche. Lo mismo ocurre con el cártamo (Carthamus tinctorius L., azafrán bastardo), que se ha modificado para que produzca insulina humana en sus semillas.




FUENTE: 

Goeddel, D. etal. 1979. “Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin”. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76: 106 – 11. Disponible en: http://www.pnas.org/content/76/1/106.full.pdf


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INSULINOTERAPIA

En la actualidad la insulina que se emplea para uso terapéutico es la sintética DNA recombinante similar a la humana.
Desde el punto de vista terapéutico la absorción lenta de la insulina se realiza desde el tejido celular subcutáneo ya que se necesita un tiempo determinado para que la insulina hexamérica se disperse y disocie la forma monomérica de menor tamaño.
En el Método Recombinante para la producción de Insulina primero, se clonan los genes con la B- galactosidasa en plásmidos pBR322. La recombinación de los plasmidos son amplificados en E.coli. Se lleva a cabo una trasnformación de la bacteria, en dos nucleotidos diferentes , luego la reacción entre la proteina B-gal y el gen de la insulina con la metionina hace que el complejo proteico cambie, expulsando de esta manera la molécula de la metionina y produciendo al final la insulina con menos a.a que al inicio del proceso.


 El mecanismo de la separación de la insulina as a través del sistema RP-HPLC







FUENTE:

Rodríguez Lay, Giovanna; Insulinoterapia; SCIELO [Internet] 2003 [citado el 14 de junio del 2015]; Volumen 14 no.3. Disponible en: 

Nathan D, Buse J, Davidson  M, Ferrannin E, Holma R et cols. Medical Management  of Hyperglycemiin Type 2 Diabetes: A Consensus Algorithm for the Initiation and Adjustment of Therapy. Diabetes Care 2009; 32: 1-11: Disponible en: http://www.clinicalascondes.com/area-academica/pdf/MED_20_5/06_Dr_Kuzmanic.pdf
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Las secuencias de ADN en diferentes individuos han revelado la existencia de polimorfismos, como la sustitución de un único nucleótido, así como también el caso de los SNP o variación en el número de repeticiones de unas secuencias en tándem que dan lugar a la formación de microsatélites y minisatélites. El análisis de estos polimorfismos puede realizarse mediante la utilización de varias técnicas, tales como la técnica de hibridación de Southern o Southern blot.




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Permite identificar regiones específicas de ADN que han sido fragmentadas por una enzima de restricción. El ADN se separa mediante electroforesis en gel de agarosa. Tras teñirlo con bromuro de etidio, el gel se fotografía bajo luz ultravioleta. Posteriormente se trata con hidróxido sódico o a altas temperaturas para desnaturaliza el ADN y romper la unión entre sus dos cadenas. Entonces el gel se neutraliza con un buffer adecuado. El ADN es transportado hasta la membrana de nitrocelulosa, a la cual se adhiere. Cuando se ha completado la transferencia, el ADN puede ser irreversiblemente unido al filtro.





REFERENCIAS:


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